MAKALELER / ET ANALİZLERİ..ET ANALİZİ..
ET VE ET ÜRÜNLERİ ANALİZLERİ
ET
Azotlu besi maddelerinin ve bu aşamada biolojik değeri yüksek hayvansal proteinlerin anorganik maddelerin ve bir çok önemli vitaminlerin başlıca kaynağı ettir. Et kasaplık hayvanların, kuşların, balıkların, kümes ve av hayvanlarının yenebilen kısımlarıdır. Et denilince yenebilen hayvanların kas kısımları yani daha ziyade kas eti anlaşılır. Et, başta kas dokusu olmak üzere kas, epitel, kemik, sinir, yağ ve bağ dokuları yapısında bulunduran hayvansal bir besin olarak tanımlanır.
Et ve Bileşenleri:
Etin başlıca bileşenleri su, protein, yağ ve anorganik maddelerdir. Az oranda da karbonhidrat, organik asitler, vitaminler ve enzimler bulunur. Yağı ayrılmış ette ortalama;
• % 70 – 75 Su
• % 13 – 22 Azotlu maddeler
• % 0.5 – 3.5 Yağ
• % 1 anorganik maddeler bulunur.
Sudan sonra en çok bulunan bileşeni olan protein etin en önemli kısmını oluşturur. En bol bulunan kas proteini, suda çözülmeyen globülin kompleksi, oktomiyosin olup kas lifinin kasılmasından sorumludur. Etin yenmeyen kısmında önemli miktarda bulunan kologen, deri, kemik ve kaslarda bağ dokusunun temel bileşimini teşkil eder. Keratin, saç, boynuz, tırnak ve epidermisin dış tabakasını oluşturur. Elastin, kemikleri ve başka organları birbirine bağlayan bağların temel proteinir ve kan proteinleri vardır.
Et de karbonhidratlardan daha çok 0.05 – 0.18 oranında glikojen bulunur. Glikojence daha zengin karaciğerdir. Glikojenin hidrolizinden teşekkül etmiş % 0,1 - 0,5 kadarda glikoz ve maltoz bulunur.
Ete bağlı olarak bulunan yağlar daha ziyade palmitin, sterin ve olain asidin oliseridlerinden yapılmışlardır. Bunun yanında % 2 miktarda kolestirin ( % 0,1 - 0,2 ) ve yaklaşık olarak % 2.6 – 5 lesitin vardır. Aktif biolojik, önemli bir temel yağ asidi arahidan asit hayvansal yağda bulunur.
Etin tuzları başlıca potasyum fosfat olmak üzere kalsiyum ve magnezyum fosfat ve NaCI'den ibarettir. Az miktarda demir, miyoglobinde bulunur.Ve pek az silis ve sülfat iyonu vardır ki bunun da hemen hepsi protein kükürtünden ileri gelir. Etin külü % 0,8 - 1,8’dir.
Karaciğer, böbrek ve kalp dışında kas eti vitaminler bakımından nispeten fakirdir. Bununla birlikte var olan tiamin, rifoblamin, niasin, ve B vitamin grubunun diğer üyeleri avitaminozu önleyecek miktardadırlar. Ette de A vitamini bulunmaktadır. C vitamini ise bazı araştırıcılara göre az miktarda vardır.
Numune alma :
1-Numune alma araç ve kapları
2-Kimyasal analizler için;
3-Numune alma araç ve kapları "kuru ve temiz olmalıdır.
4-Duyusal analizler için;
5-Numune alma araç ve kapları kuru, temiz olmalıdır. Mamule herhangi bir tat, koku bulaştırmamalıdır.
Numune Alma İşlemi:
Herhangi bir büyüklükte olup tek başına paketlenmiş veya hazırlanmış et ve et mamulleri ile ağırlıkları 2 kg'ı geçmeyen et parçaları (sosisler ve konserve mamulleri gibi)
Bir birim veya parçanın tümü partiyi temsil edecek miktarda ilk numune olarak alınır.
-Karkaslar veya ağırlıkları 2. kg'ı geçen et parçaları (kol, but kuzu karkasları gibi)
Partiyi temsil edecek miktarda alınan et numuneleri, duyusal muayeneler veya laboratuarda yapılacak deney ve muayeneler (kimyasal veya bakteriyolojik) için ayrılırlar.
Karkas veya büyük et parçasından numune hiçbir zaman bütünü temsil edemez. Bu nedenle ilk numunenin alınışında, numunenin alınış amacına göre aşağıdaki yöntemlerden biri uygulanır.
a)Yüzey numuneleri (Örn: koliform veya salmonella tayini için); etin bütün yüzeyi, pens ile tutulan ve steril su ile nemlendirilmiş büyük bir pamukla silinerek alınır.
b)Laboratuarda yapılacak kimyasal deney ve bakteriyolojik muayeneler için 500 g - 1.000 g ağırlığındaki kesilmiş parçalar, mümkün olduğunda, daha önce kesilmiş olan bir yerden ve ete en az zarar verecek biçimde alınmalıdır.
c)Kemik seviyesinde, deride oluşan kokuşmaların nedenlerini anlamak amacı ile yapılacak bakteriyolojik muayeneler için derin kas numuneleri, karkasın bozulma görülen kısmından paslanmaz çelik, steril bir myectom ile veya dondurulmuş etlerde matkapla alınmalıdır.
d)Yağ numuneleri mümkün olduğunca böbrek yağından alınmalıdır.
Şüphe üzerine satış yerlerinden örnek alınırken kaide olarak et numunelerinden tam durumdaki bir adedi alınır. Bir paralel örneğin de soğukta korunmak üzere "şahit numune" olarak ayrılması gerekir.
Örnekler bir tutanakla laboratuara sevk edilir. Bütün halindeki örnek parşömen kağıdına veya selofan folyaya sarılarak gönderilmelidir. Bu amaçla polietilen folya veya tabakalardan da yararlanılabilir. Örnekler; Mümkün olduğu kadar steril koşullarda alınmalıdır. (steril pens, makas, cam kavanozlar)
Alınan et ürünü örneklerinin en geç 2 saat içerisinde laboratuara ulaştırılması gerekir, gönderme süresinin 2 saati aşacağı durumlarda örneklerin ısı derecesi 4-9°C olan termos, çanta veya kutularda taşınması veya gönderilmesi sağlanmalıdır.
HİSTOLOJİK MUAYENELER
ET VE MAMULLERİ – HİSTOLOJİK MUAYENELER
Sucuk, sosis ve salamda, kendi standardının katılmasını yasakladığı iç organ, sıfak, tendo gibi etten başka maddelerin araştırılmasında fiziksel ve histolojik muayeneler yapılır. Histolojik muayene yapılamadığı hallerde kuvars lambası veya maserasyon deneyleri uygulanır.
Araç - Gereç :
- Analitik terazi, ± 0,1 g duyarlıkta
- Mikrotom
- Porselen kap, ortası çukur
- Mikroskop
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
- Formalin çözeltisi, % 10'luk
- Eter
- Erlich'im asit hematoksilen çözeltisi
- Hidroklorik asit çözeltisi, seyreltik
- Eosin çözeltisi, % 10'luk
- Alkol, % 96'lık
- Ksilol
- Kanada balzamı
İşlem :
Numunenin çeşitli yerlerinden olmak üzere en az 125g alınır. Bu numunelerden yüzeyi 1 - 3 ve derinliği 5 mm olan parçalar kesilir. Bu parçalar % 10'luk formalin çözeltisinde 12 ila 24 saat tespit edilmek üzere bırakılır.
Çok yağlı numuneler önce eterden geçirilerek yağı alınmalıdır. Formalin çözeltisinde tespit olunan parçalar çıkarılır. Ağzı delik mantarlı bir kaba konarak bol su ile yıkanır. Bu maksatla kap 2 saat kadar su altında tutulur ve parçalar jiletle düzeltilerek dondurma mikrotomunda dondurulur.
Mikrotomda 10 - 12 mikron kalınlığında olmak üzere kesilir ve bu kesitler ya damıtık su veya kaynatılmış ve soğutulmuş suya atılır. Sonra boyamaya geçilir.
Boyama;
3 adet ortası çukur porselen kap alınır. Birine Erlich'in asit hematoksilen çözeltisi, diğerine adi su, üçüncüsüne de seyreltik hidroklorik asit çözeltisi konur. Sudan alınan kesit önce hematoksilen içine atılır ve burada yaklaşık olarak 8 dakika tutulur. Buradan çıkarılarak içinde su bulunan ikinci kaba konur ve yıkanır. Sonra içinde seyreltik hidroklorik asit olan kaba konur, rengi çıkmayıncaya kadar deklore edilir. Buradan içi su ile dolu cam kaplara alınır. En az iki saat suyu değiştirilmek suretiyle yıkanır.
Kesit buradan alınarak % 10'luk Eosin çözeltisi içine atılır, iki dakika boyanır. Buradan çıkarılarak 96°C'lik alkolde deklore edilir. Tekrar suya alınır. Daha önceden iyice yağı giderilmiş lam, suya daldırılarak bir ince fırça veya öze yardımı ile kesit, lam üzerine alınır. Kurumaya bırakılır. İyice kuruduktan sonra ksilol'e daldırılıp çıkarılır, ıslak iken üzerine bir damla Kanada balzamı konur ve arada hava kalmayacak şekilde üzerine lamel konarak kapatılır, kurumaya bırakılır ve sonra daldırma mikroskop altında dokuların durumu incelenerek içinde iç organlar olup olmadığı tespit olunur.
SEROLOJİK MUAYENE
ET VE MAMULLERİ – SEROLOJİK MUAYENE
Etin hangi hayvan türüne ait olduğunu tespit etmek için serolojik muayene yapılır. Ayrıca mikrobiyolojik muayenede sonuç alınamayan hallerde de aglutinan serumlarla serolojik muayeneye baş vurulur. Etin türünü tespit için yapılacak serolojik muayenede çöktürme (precipitation) deneyi uygulanır.
I. YÖNTEM : Çöktürme Deneyi ile Serolojik Muayene
Araç ve Gereç :
- Etüv; 37°C'ye ayarlanabilen
- Askoli tüpleri
- Porselen havan
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
Çeşitli hayvan etlerine karşı hazırlanmış çöktürücü (presipitan) serumlar.
- Tuzlu su (serum fizyolojik) veya steril damıtık su; % 0,9'luk steril
- Steril kum
İşlem :
Yağlarından iyice ayrılmış olan 30 g kadar numuneye 50 ml steril tuzlu su katılarak küçük parçalara ayrılıncaya kadar dikkatle steril porselen havanda bir miktar steril kumla ezilir. Bir gece buzdolabında bırakılır.
Duruma göre iki saat 37°C'lık etüvde bırakılmak suretiyle aynı sonuç elde edilir. Ertesi gün ezilen numune pamuk, süzgeç kağıdı veya asbestten süzülerek berraklaştırılır. Bu süzüntünün kullanılmağa elverişli olup olmadığı, 1ml'lik süzüntüye % 1'lik nitrik asit çözeltisinden ve sulfosalisilik asitten bir iki damla damlatılarak anlaşılır, hafif test için yeteri derecede proteinli maddelerin geçtiğini gösterir. Süzüntü nötr olmalıdır, değilse sodyum hidroksit çözeltisi ile nötr hale getirilmelidir.
Reaksiyon ASKOLİ tüplerinde uygulanmalıdır. Tüp bulunmadığı tüp bulunmadığı takdirde ucu çekilmiş pastör pipeti de kullanılabilir. Askoli tüpüne önce süzüntüden daha sonra dikkatle 0,05 ml anti - serumlardan katılır. Tüpler 20 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Süzüntü ile antiserum arasında oluşan beyaz halka, kullanılan seruma ait etin bulunduğunu gösterir. Denemede kullanılacak olan serumlar 1/1000 - 1/10.000 - 1/20.000 duyarlı olmalıdır.
Şarbon aranmasında aynı deney uygulanır, ancak burada kullanılacak serum, şarbona karşı hazırlanmış antipresipiten serumdur.
II. YÖNTEM :
Agglutinasyon Deneyi ile Serolojik Muayene
Salmonella, Coli, Brucella, Proteus, Paratifo A, Paratifo B ve benzeri patogen mikroorganizmaların tespitinde bu mikroplara karşı hazırlanmış özel agglutinan serumlar kullanılarak yapılacak serolojik muayenede agglutinasyon deneyi uygulanır.
Araç - Gereç :
- Lam
- Öze
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
- Agglutinan Serumlar
İşlem : Şüpheli mikrop kolonisi çok az bir miktar fizyolojik tuzlu su ile karıştırılır, bundan bir öze dolusu alınarak lamın bir köşesine konur. Bunun yanına agglutinan serumdan bir damla ilave edilir ve öze yardımı ile iyice karıştırılır.
Lam elde tutularak devir hareketleri yapılır. 1 - 2 dakika içinde topaklaşmalar görülürse, agglutinasyon müspettir, hangi mikrobun agglutinan serumu kullanılmışsa o mikrop üremiş demektir. (Kaynak 2)
SEROLOJİK MUAYENE
ET VE MAMULLERİ – SEROLOJİK MUAYENE
Etin hangi hayvan türüne ait olduğunu tespit etmek için serolojik muayene yapılır. Ayrıca mikrobiyolojik muayenede sonuç alınamayan hallerde de aglutinan serumlarla serolojik muayeneye baş vurulur. Etin türünü tespit için yapılacak serolojik muayenede çöktürme (precipitation) deneyi uygulanır.
I. YÖNTEM : Çöktürme Deneyi ile Serolojik Muayene
Araç ve Gereç :
- Etüv; 37°C'ye ayarlanabilen
- Askoli tüpleri
- Porselen havan
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
Çeşitli hayvan etlerine karşı hazırlanmış çöktürücü (presipitan) serumlar.
- Tuzlu su (serum fizyolojik) veya steril damıtık su; % 0,9'luk steril
- Steril kum
İşlem :
Yağlarından iyice ayrılmış olan 30 g kadar numuneye 50 ml steril tuzlu su katılarak küçük parçalara ayrılıncaya kadar dikkatle steril porselen havanda bir miktar steril kumla ezilir. Bir gece buzdolabında bırakılır.
Duruma göre iki saat 37°C'lık etüvde bırakılmak suretiyle aynı sonuç elde edilir. Ertesi gün ezilen numune pamuk, süzgeç kağıdı veya asbestten süzülerek berraklaştırılır. Bu süzüntünün kullanılmağa elverişli olup olmadığı, 1ml'lik süzüntüye % 1'lik nitrik asit çözeltisinden ve sulfosalisilik asitten bir iki damla damlatılarak anlaşılır, hafif test için yeteri derecede proteinli maddelerin geçtiğini gösterir. Süzüntü nötr olmalıdır, değilse sodyum hidroksit çözeltisi ile nötr hale getirilmelidir.
Reaksiyon ASKOLİ tüplerinde uygulanmalıdır. Tüp bulunmadığı tüp bulunmadığı takdirde ucu çekilmiş pastör pipeti de kullanılabilir. Askoli tüpüne önce süzüntüden daha sonra dikkatle 0,05 ml anti - serumlardan katılır. Tüpler 20 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Süzüntü ile antiserum arasında oluşan beyaz halka, kullanılan seruma ait etin bulunduğunu gösterir. Denemede kullanılacak olan serumlar 1/1000 - 1/10.000 - 1/20.000 duyarlı olmalıdır.
Şarbon aranmasında aynı deney uygulanır, ancak burada kullanılacak serum, şarbona karşı hazırlanmış antipresipiten serumdur.
II. YÖNTEM : Agglutinasyon Deneyi ile Serolojik Muayene
Salmonella, Coli, Brucella, Proteus, Paratifo A, Paratifo B ve benzeri patogen mikroorganizmaların tespitinde bu mikroplara karşı hazırlanmış özel agglutinan serumlar kullanılarak yapılacak serolojik muayenede agglutinasyon deneyi uygulanır.
Araç - Gereç :
- Lam
- Öze
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
- Agglutinan Serumlar
İşlem : Şüpheli mikrop kolonisi çok az bir miktar fizyolojik tuzlu su ile karıştırılır, bundan bir öze dolusu alınarak lamın bir köşesine konur. Bunun yanına agglutinan serumdan bir damla ilave edilir ve öze yardımı ile iyice karıştırılır.
Lam elde tutularak devir hareketleri yapılır. 1 - 2 dakika içinde topaklaşmalar görülürse, agglutinasyon müspettir, hangi mikrobun agglutinan serumu kullanılmışsa o mikrop üremiş demektir.
ET VE ET ÜRÜNLERİNDE DUYUSAL MUAYENE :
Burada etlerin fiziki vasıflarından bahsedilecektir.
Etin Rengi: Soluk, hafif kırmızı ve koyu kırmızı arasında farklar gösterir. Etin rengi, hayvan nevilerine göre farklı olduğu gibi, aynı neviye ait hayvanlarda da verilen yeme, hayvanın dişiliğine, erkekliğine, yaşına göre de farklılıklar gösterir. Etin rengi, adale primitif fibrinlerinin havi olduğu hemoglobin miktarına bağlıdır. Etin renkli maddesi kimyevi olarak hemoglobinin aynıdır. Fakat bu madde ette, adale fibrinlerinin myonisi ile birleşmiş bir halde bulunur. Bu tarzda etin az çok kırmızı renkte görülmesinde tesiri vardır. Etteki hemoglobin miktarı, adalelerin çalışmaları nispetinde fazladır. Bunun için uzviyet içerisinde en koyu olanlar kalp ve diyafragma kaslarıdır. Tavşan ve tavuklarda, yaşadıkları müddetçe etler soluk renktedir. Kasaplık hayvanların etleri ise, süt emdikleri devrede az çok beyaz soluk kırmızı renktedir. Sütle semirtilen danaların etleri, hemen hemen altıncı aya kadar beyaz renkte görünürler, bunların yağları da çok beyazdır. Genç ineklerin ve öküzlerin etleri açık kırmızı renktedir. Boğaların etleri ise, hemoglobinin fazlalığı dolayısıyla koyu kırmızıdır. Mezbahada veya dışarıda kesilen hayvanlarda etlerin fazla kanlı bulunması, bir hastalık neticesinde kalp faaliyetinin azalarak kesim esnasında kanın iyi akmadığına delalet eder.
Etin ve yağın evsafı üzerinde yemin de büyük tesiri vardır. Fazla miktarda balıkla beslenen domuzlarda, ette balık yağı kokusu ve lezzeti görülür. Sığırlar fazla miktarda ve uzun zaman yağ fabrikaları küspeleriyle beslendikte, etlerinin ve yağlarının fiziki evsafı ve kimyevi terkipleri dolayısıyla da lezzeti üzerinde kötü tesirler hissedilir. İyi lezzetli bir et merada beslenen hayvanlardan elde edilir.
Etlerin koku ve lezzeti de kasaplık hayvan nevine has olmak üzere hususiyetler gösterir. Etlerde ahır ve süt kokusu duyulabilir.
ET VE ET ÜRÜNLERİNDE FİZİKSEL MUAYENELER
a- pH değerinin ölçümü
Elektro pH metreler kullanılarak yapılır. Laboratuara gönderilen etler ve et ürünlerinden hazırlanan homojenizatta pH değeri ölçülür. Üretim yerlerinde ise genellikle portatif pH metreler kullanılarak doğrudan doğruya ürün üzerinde ölçümler yapılır. (Resim 1)
Örneğin hazırlanması: Et ürünü yüksek devirli homojenizatörler (Ultra-Turrax) kullanılarak homojenize edilir. Homojenizattan uygun bir miktar temiz bir behere aktarılır. Behere alınan homojenizatın pH metrenin elektrotlarını örtecek yükseklikte olması gerekir.
Elektro pH metrenin ayarlanması: Isı derecesi ölçümün yapıldığı yerin sıcaklığına yakın olan tampon solüsyonuyla pH metre ayarlanır.
Ölçüm: pH metre, homojenizatın ısı derecesine göre ayarlanır. Ayar düğmesi bulunmayan modellerin kullanılması halinde, örneğin ısı derecesi 20'C'a ayarlanır. En az iki ölçüm yapılarak ortalama değer esas olarak alınır.
Elektrodun temizlenmesi: İkinci bir ölçüme geçilmeden önce pH metrenin elektrodu % 96'lık etil alkol veya su ile doyurulmuş dietil eterle silinerek temizlenir ve destile su ile yıkanır. Elektrod doymuş potasyum klorür eriyiğinde tutularak korunmalıdır. Birleşik elektrotların ise destile suya daldırılmış durumda bekletilmesi gerekir.
Portatif pH metrelerle yapılan ölçümde ise özel kılıf içerisindeki (korumak) elektrod et ürününe saplanır. Sert yapılı ürünlerde ve cam elektrotların kullanılması halinde, önceden ürüne uygun bir kanalın açılması gerekir. Elektrodun et ürünüyle tam temasını sağlamak için kanalın içersine birkaç damla destile su damlatılmalıdır.
b- Redoks potansiyelin ölçümü
Redüksiyon ve oksidasyon olayında kaide olarak bir proton geçişi söz konusudur. Bu nedenle redokspotansiyel sistemin o andaki pH değerine bağlı kalır. Burada ters bir orantı vardır. Ortamın pH değerinin yükselmesiyle redokspotansiyeli azalır. Buna dayanarak pH değerleri esas alınmak suretiyle bunlara karşı gelen redokspotansiyeli değerleri "rH" ile gösterilmiş ve bir cetvel haline getirilmiştir. Elektrometrik ölçümlerde rH değeri elektrotlar arasındaki potansiyel farkından hesaplanır. Platin elektrodun doyurulmuş kalomel elektroduna karşı verdiği ölçü değeri E ile gösterilir. Bu değerden yararlanılarak aşağıdaki formülden rH değeri bulunur.
E + 57 . 73 pH
rH = (18'C)
28 . 86
Redokspotansiyelin ölçümü hassas olarak, doyurulmuş kalomel veya gümüş klorür elektroduyla bağlantılı bir platin elektrod yardımıyla yapılır. Elekrodlar arasındaki gerilim, bir gerilim ölçme aletiyle belirlenir. Ölçüm sırasında ortamda oksijen bulunmamalıdır. Oksijenin iz halinde mevcudiyeti bile sonucu etkiler. Platin elektrod bir süre HCI'de tutulur ve alevde yakılır. Platin elektrodun yüzeyi yeterince geniş olmalıdır. Aksi halde potansiyel ayarlaması yavaşlar. Sabit bir potansiyelin sağlanması çoğunlukla birkaç saat sürer.
Redokspotansiyel, pH ölçümlerinde kullanılan indikatörlerden yararlanılarak da ölçülebilir. Burada elektrometrik ölçümde olduğu gibi ortama oksijen girmemelidir. İndikatörlerin eriyik şekilleri dayanıksız olduğundan her ölçüm için taze hazırlanmaları gerekir.
c- Su aktivitesi değerinin (aw,) ölçümü
Su aktivitesi deyimi altında üründeki toplam suyun kimyasal veya fiziksel biçimde bağlanmış olan kısmı veya ortam suyunun buhar basıncının doymuş buhar basıncına bölünmesiyle elde edilen değer anlaşılır.
Et ürünlerinde bulunan mikroorganizmaların çoğunluğu ortamdaki serbest su sayesinde yaşamlarını sürdürürler. Bunun gerçekleşebilmesi için besin maddesinin su aktivitesi değerinin (aw) mikroorganizmaların ****bolizma faaliyetlerine imkan verecek düzeyde olması gerekir. Bu nedenle aw değerinin ölçümü besin hijyeninde önem taşır. Su aktivitesi 0.0 ile 1.0 arasında değişen rakamlar halinde ifade edilir. Çeşitli tuzları ve çözünebilen diğer maddeleri içermeyen destile suyun su aktivitesi değeri 1.0'dır Tamamen kuru, yani su içermeyen bir gıda maddesinin aw değeri ise 0.0'dır.
Et ürünlerinin su aktivitesi değeri uygulanan tuzlama, kurutma, dondurma gibi teknolojik işlemlerle azaltılır.
Mikroorganizmalar tarafından kullanılan su miktarı, yani aw değeri aşağıdaki formülden bulunur.
aw =
P : Üründeki su basıncı
PS : Doymuş buhar basıncı (en yüksek düzeydeki su buharı basıncı)
Özellikle olgunlaşma döneminde bulunan fermente sucuklara uygulanan aw değeri ölçümleri önceleri klasik metodlarla yapılmıştır. Günümüzde gelişmiş olan cihazlarla seri ölçümler yapılabilmektedir. (Resim 2)
d- Ultraviyole ışığı altında inceleme
Özellikle fermente sucuklardan hazırlanan kesitler dalga uzunluğu 250-285 milimikron arasında değişen quarz lambası altında tutularak ultraviyole ışığında gösterdikleri flüoresans ve renk değişimleri açısından değerlendirilirler. Bu yöntemle sucukta mevcut belirti doku parçaları hakkında bir fikir edinmek mümkündür.
Bağ doku, kıkırdak ve kemik parçaları kuvvetli mavimsi beyaz, tendo ve fascia parçaları beyazdan mavimsi beyaza kadar değişen bir flüoresans verirler. Yağ dokusuna ait kısımlar flüoresans oluşturmaz. Ancak gri beyazdan gri menekşeye kadar değişen bir renkte görülürler. Et ve akciğer parçaları soluk kırmızısı bir renkte fark edilir, fakat birbirlerinden ayırt edilemezler.
Bir değerlendirmenin yapılabilmesi için çok sayıda kesit incelenmeli ve edinilen kanaat "bol miktarda","az miktarda" veya "çok az miktarda" şeklinde ifade edilmelidir.
ET VE ET ÜRÜNLERİNDE KİMYASAL MUAYENELER
Numune Alma ve Homojenizasyon
Tam bir analiz neticesi almak için, numunenin homojen şekilde karışımının sağlanması şarttır. Bu durum numunenin homojenize edilme derecesi ile yakından ilgilidir. Bazen mamul madde üretiminde tanı veya tama yakın bir yeknesaklık elde edilebilmektedir. Bu gibi maddelerden alınan küçük bir numuneden oldukça güvenilir analiz neticeleri alınabilir. Her şeye rağmen, numunenin tam bir homojenizasyonun sağlanması gerekir. Homojenizasyon, numunenin yapısına göre bagetle olabildiği gibi, 3 kere kıyma makinesinden çekilmekle veya bir mixer yardımıyla da olabilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken nokta numunenin yüksek devirde dönen bıçaklar arasında ısınmadan dolayı suyunu kaybetmemesinin sağlanmasıdır. Özel durumlarda, donmuş halde bulunan numunelerin homojenize edilmelerinde kullanılan kıyma makineleri bıçaklarının da soğutulmaları gerekmektedir.
Homojenize edilen numune, hemen ağzı kapanan kaplara konarak işlemleri yapılmasına kadar buzdolabında saklanması gerekmektedir. Bu sırada, sıvı numunelerin sulu kısımları ayrılaşabilir. Bu durumun önüne geçmek için, buzdolabından çıkan numune kabının çalkalanması yeterlidir.
Gıda Maddeleri Mevzuatının 182. maddesi muayene ve tahlil için alınan sucuk numunesi miktarını en aşağı 150g. olarak saptamaktadır.
KİMYASAL MUAYENELER
1- BAĞLAYICI DOKU TAYİNİ
ET VE MAMÜLLERİ – BAĞLAYICI DOKU TAYİNİ
Araç – Gereç:
- Analitik terazi; 0.1 gr. duyarlıkta
- Süzgeç kağıdı
- Genel laboratuar araç gereçleri
İşlem :
Deney numunesinden 50 gr alınır, soğuk su ile 3 - 4 saat maserasyon işlemi uygulanır, süzülür. Süzgeç kağıdının üstünde kalan kısım bir behere konarak su ile kaynatılır. Bağlayıcı dokular eridikten sonra süzülür. Süzüntü litreye tamamlanır. Bundan belli bir miktar alınarak kjeldahl ile azot tayin edilir. (Kod No: 166.04) Bulunan azot miktarı 5,55 ile çarpılarak bağlayıcı doku protein miktarı bulunur. Toplam Protein miktarından, bağlayıcı doku protein miktarı çıkarılarak numunedeki hazmolabilir protein yüzdesi bulunur.
2- ET ÜRÜNLERİNDE BOYA MADDELERİNİN BELİRLENMESİ: (BGA(x) Standard Metodu)
a. Uygulama alanı Metod, gıda renk maddelerinin et, fermente ve ısı işlemi görmüş et ürünlerinden separasyonu, purifıkasyonu ve identifıkasyonu amacıyla uygulanır.
b. Prensip
Metod, örnekteki renk maddesinin bir solvent'de süspansiyon haline getirildikten sonra elde edilen süzüntünün bir adsorbana emdirilmesi ve purifıye edilen adsorbanadan ince tabaka kromatografisi veya spektral fotometri ile identifiye edilmesi esasına dayanır.
c. Araç ve gereçler
Renk maddelerinin izolasyonunda kullanılanlar:
- Mikrokromatografi boruları (iç çaplar 8, 10, 25 mm, 3 mm x 100 mm ölçülerinde bir çıkış borusuyla donatılmış, toplam uzunluk 250 mm).
- Cam pamuğu
- Soxhlet ekstraksiyon apareyi
- Su hamamı
- Rotasyon buharlaştırıcısı
- Blendır
- Porselen havan
- Etüv
Renk maddelerinin identifikasyonunda kullanılanlar:
- İnce tabaka kromatografisi için komple teçhizat
- Hazır selluloz plakları Kieselgel hazır plakları
- Spektrofotometre
d. Kimyasal maddeler
Renk maddelerinin izolasyonunda kullanılanlar:
- Kolon kromatografisi için toz halinde poliamid
- Yün iplikler
- Deniz kumu (arındırılmış)
- Selit
- Asetik asit (%10’luk)
- Amonyak solüsyonu (%5’lik)
- ****nol
- Etanol
- Petroleter (kaynama derecesi 40-60C arasında)
- Aseton
- Dimetilformamid
- Kloroform
- Diklor****n
- Elusyon karışımı (%25’lik ****nol’le hazırlanmış amonyak solüsyonu, hacmen 5 + 95 kısımdan oluşmak üzere)
- Akışkan karışımı (25 g/L trisodyum sitrat-dihidrat solüsyonu, amonyak solüsyonu, amonyak solüsyonu ve %25’lik ****nolden hacmen 80 + 20 + 12 oranında hazırlanmış)
Yağda eriyenrenk maddeleri için akışkan karışımı (kloroform ve ****nolden hacmen 20 + 80 oranında hazırlanmış)
e. İşlem
Renk maddelerinin izolasyonu, saflaştırılması ve zenginleştirilmesi
- Mikrokromatografi borusunun hazırlanması:
Mikrokromatografi kolonunun alt kısmı az miktarda cam pamuğu ile kapatılır ve konik kısmını kaplayacak kadar deniz kumu ile doldurulur. Sonra pozisyonuna getirilir ve alt kısmına bir toplama beheri yerleştirilir
Mikro kromatografi kolonunun çapı kullanılacak örneğin miktarına ve bu örnekten elde edilmesi tahmin edilen renk maddesinin oranına göre seçilmelidir. Renkli görünüm veren et ürünlerinde çapı dar borular tercih edilir. Renk maddelerinin purifikasyonu için de yine çapı küçük boruların kullanılması gerekir.
Yün ipliklerin hazırlanması:
Yün, soxhlet cihazında petroleter kullanılarak 25-30 sirkülasyonla yağından arındırılır. Havada iyice kurutulduktan sonra büyük bir beherde %25'lik etanolle hazırlanmış amonyak solüsyonuyla 1 saat muamele edilir. Bu sırada beher ısıtılır ve içerik sık sık karıştırılır. Sonra suda yıkanır ve bir gece boyunca cam çubuklara asılmış durumda kurutulur.
f. Renk maddesinin ısı işlemi görmüş et ürünlerinden separasyonu
Örnek blendırda ufalanır ve homojenize edilir. Bundan alınan 10 g'lık kısım 3 g deniz kumu ve 3 g selit ile havanda iyice karıştırılır, yağ ve suyun uzaklaştırılması için 3-4 kere her defasında 30-40 ml kadar aseton sarf edilmek üzere ezilir. Aseton her defasında dekante edilir ve içinde herhangi bir şekilde yağda eriyen renk maddesi yoksa, atılır. Asetonda yağda eriyen renk maddeleri kalmışsa, aseton destile edilir ve elde edilen kalıntı petroletere alınarak işlenir.
Yağda erimeyen renk maddelerini ayırmak için muamele edilen örneğe ait kısım mevcut olabilecek asetonun uzaklaştırılması amacıyla 30 dakika 90'C'a ayarlı kurutma dolabında bekletilir. Dolaptan çıkarılan örnek yeniden iyice ezilerek toz haline getirilir, hazır durumdaki mikrokromatograf borusuna doldurulur. Renk maddesini proteinden ayırmak için elusyon karışımından her defasında 5'er ml'lik miktarlar toz halindeki kütle üzerine dökülür. İşleme dışarı alınan eluatin rengi kayboluncaya kadar devam edilir. Alınan eluat asetik asitle asitlendirilir, su ile hacminin üç misline kadar inceltilir. Sonra üzerine 0.5 ile 1g kadar poliamid tozu konulur. Poliamidle muameleden sonra bazen eriyiğin renkli kaldığı görülebilir. Bu durum tabii renk maddelerine bağlıdır. Eriyik 60ºC'a kadar ısıtıldıktan sonra önceden hazırlanmış yün ipliğine adsorbe ettirilebilir.
g. Renk maddesinin fermente et ürünlerinden separasyonu
Örnekten ayrılan 50g’lık parça blendorda ufalanır, homojenize edilir ve kurutma dolabında 60ºC da bir gece boyu kurutulur. Kuru kütle Soxhlet ekstraktöründe diklor****nla yağından arındırılır (yakl. 20 sirkülasyon). Bazen diklor****n ekstraksiyondan sonra boyanır. Nedeni tabii renk maddeleridir. Soxhlet cihazından alınan kartuş açılarak içeriği bir behere aktarılır, artan eritici buharlaştırılır. İçerik 150 - 200 ml kadar amonyak solüsyonuyla 2-3 dakika kaynatılır ve sıvı kısım dekante edilir. Ekstraksiyon işlemi her seferinde 50 ml amonyak solüsyonu kullanılmak suretiyle 2 defa tekrarlanır. Ekstraktın asetik asitle asitleştirilmesinden sonra 0.5 - 1 g poliamid tozu ilave edilir. Koşnil renk maddesinin poliamidle reaksiyona girmesini önlemek için purifikasyon ve desorpsiyon işlemlerinin süratle yapılması gerekir.
Adsorpsiyon, eriyiğin ısıtılmadan veya 60ºC'a kadar ısıtıldıktan sonra önceden hazırlanmış yün iplikleriyle gerçekleştirilebilir.
h. Poliamid metoduyla saflaştırma ve zenginleştirme
Adsorbe edilmiş renk maddesiyle poliamid tozunu içeren süspansiyon iyice çalkalandıktan sonra sıcak olarak (yakl. 60ºC) önceden hazır vaziyete getirilmiş kromatografi borusuna aktarılır, 20 ml kaynar su ile 6 defa ve 5 ml ****nol ile 3 defa elue edilmek suretiyle şeker ve asitlerden arındırılır. Renk maddelerinin elusyonu için elusyon karışımı birkaç kere 5 ml'lik miktarlar halinde kolona verilir. İşleme elusyonun tam oluşmasına kadar devam edilir. Çoğunlukla küçük.miktarlar halinde tabii renk maddeleri de birlikte elue edilir. Fakat bu tabii renk maddeleri, sentetik renk maddelerinin belirlenmesinde bir engel teşkil etmezler. Renk maddelerinin dekompoze olmasını önlemek için eluat asetik asitle asitleştirilir. Elusyonda cüzi renk maddesi konsantrasyonlarını içeren büyük sıvı kitlelerinin oluşması halinde, poliamid tozuna yeniden adsorpsiyon yapılarak zenginleştirme (yoğunlaştırma) sağlanır. Ancak burada az miktarda poliamidle (yak. 0.2 g) çalışılmalıdır. Zenginleştirme işlemi aynı zamanda reaksiyonu bozan maddelerin ayrılmasını sağladığından elue edilmiş renk maddelerinin ikinci, hatta üçüncü bir adsorpsiyona tabi tutulmasında yarar vardır. Asit karakter kazanmış olan eluat bir su banyosunda veya rotasyon buharlaştırıcısında yoğunlaştırılır.
i. Yün ipliği metoduyla saflaştırma ve zenginleştirme Şekerleri ve fenollü maddeleri içeren et ürünlerinin kullanılması halinde, renk maddelerinin başka bir maddeye aktarılması saflaştırma açısından avantaj sağlar: Yüne çektirilmiş renk maddeleri zayıf amonyak solüsyonunda, gerekirse biraz detanol katılarak su banyosunda yünden çözülerek alınırlar. Sonra eriyik buharlaştırılır ve geri kalan kısım sulandırılıp asitlendirilir ve renk maddesi yeniden yüne emdirilir. Boyanan yün iplikler tekrar su ile yıkanır ve belirtildiği şekilde çözülerek ayrılır. Eluat'ın reaksiyonu asit değilse, asetik asitle asidik hale getirilir. Sonra su banyosunda veya rotasyon buharlaştırıcısında yoğunlaştırılır.
j. Yağda eriyen renk maddeleri için spesifik poliamid metodu
Renk maddesini içeren petroleter solüsyonu 3 defa 30'ar ml dimetilformamid ile çalkalanır. Sonra dimetilformamid'li ekstraktlar iki defa 10'ar ml petroleter'le çalkalanır. Böylece ekstrakt içinde bulunabilecek yağ uzaklaştırılır. Müteakiben dimetilformamid eriyiği ayni hacimdeki su ile seyreltilir ve ortamda bulunabilecek petroleter vakum altındaki rotasyon buharlaştırıcısında destilasyonla ayrılır.
Dimetilformamid eriyiğinin bir bölümü hazır hale getirilmiş mikrokromatografi borusuna verilir. Sonra birkaç defa su ile yıkanır ve laktoflavin'in kısmen elue edilmesi sağlanır. Hemen sonra yaklaşık 15 ml ****nol'le yıkanır. Bu suretle laktoflavin ve serez kırmızısı elue edilir. Müteakiben 20 ml kloroform ve 13 ml elusyon karışımı ile desorbe edilir. Burada kloroform β - karoten'i, elusyon karışımı ise biksin ve kurkumayı elue eder. Fraksiyonlar ayrı ayrı alınır, vakum altında dikkatle yoğunlaştırılır ve renk maddesi ince tabaka kromatografisiyle identifiye edilir.
k. İdentifikasyon
Koyulaştırılmış eluat'ın içerdiği renk maddeleri ince tabaka kromatografisiyle ve gerekirse spektrofotometrik olarak identifiye edilirler.
Eluatın akışkan karışımı kullanılarak şerit şeklinde (bandlar halinde) aplikasyonuyla yapılan separasyonda hazır selluloz plaklar iyi sonuçlar verir. Kaide olarak en iyi ayırım, eluatın start noktasına renk maddesinin farkedilebileceği kadar bırakılmasıyla sağlanır. Kesin bir hüküm verilebilmesi için farklı hacimlerdeki eluatın aplike edilmesi gerekir. Çünkü renk maddelerinin karışımdaki oranları değişik olabilir. Kromatogram üzerinde “uç” tabir edilen çıkıntıların oluşması, reaksiyonu bozan maddelerin varlığından ileri gelir. Yeniden yapılacak adrosrpsiyon, kaynar su ile yıkama ve bunu izleyen desorpsiyonla bu hatayı gidermek mümkündür.
Renk maddelerinin kati identifikasyonu; varlığı tahmin edilen renk standartlarının da örneklerle birlikte kromatograma aplike edilmesiyle yapılan kromatografı ile mümkündür. Eluat ve standartlar kromatograma nokta veya band şeklinde aplike edilirler. Şüpheli durumlarda eluata ait renk maddelerinin su ve etanol ile elue edilmesi gerekir. Absorpsiyon spektrumlarının identifitesi, standart renk maddelerinin spektrumlarıyla karşılaştırılmak suretiyle bulunur.
İdentifikasyonda yağda eriyen renk maddeleri söz konusu ise, ayrım akışkan karışımı kullanmak suretiyle kieselgel hazır plaklarında gerçekleştirilir.
3. ET VE ET ÜRÜNLERİNDE HAM SELÜLOZ (HAM LİF) TAYİNİ
ET, KEMİK UNU, BAHARAT – HAMSELÜLOZ TAYİNİ :Yöntemin İlkesi : Numunenin örtücü çözelti ile (asit bir karışım) örtülerek, ısıtılması, kalıntının asetik asit ile muamele edilmesi, sıcak su ile yıkandıktan sonra değişmez ağırlığa kadar ısıtılarak tartılması, kalıntının küllendirilmesi, kül kısmının tartıdan çıkarılarak; geriye kalan ağırlığın bulunması ilkesine dayanır.
Araç - Gereç : - Analitik terazi ± 0,001 g duyarlıkta
- Etüv, 105 ± 1°C'de tutulabilen
- Kül fırını 525 ± 25°C'de tutulabilen
- Dik soğutucu
- Beher, 100 ve 200 ml'lik
- Erlen, 100 ve 200 ml'lik
- Pipetler, 5, 10 ve 25 ml'lik
- Cam huni
- Süzgeç kağıdı
- Kaynatma balonu, 250 - 300 ml'lik
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve çözeltiler : - Örtücü çözelti; 70 ml % 70'lik, asetik asit, 5 ml derişik nitrik asit ve 2 g triklorasetik ile hazırlanır.
- Asetik asit, % 70'lik
- Etil alkol, % 96'lık
- Eter
- Aseton
- Sıcak destile su
İşlem :
1 g numune tartılır ve kaynatma balonuna konulur, üzerine 25 ml örtücü çözelti katılır ve dik soğutucuya bağlanır. 30 dakika doğrudan doğruya kaynatılır, sonra balon alevden geri çekilir, su akımı ile soğutulur, önceden tartılıp darası alınmış bir süzgeçten süzülür. En son damla da süzülünceye kadar beklenir, süzgeç ve balon % 70'lik asetik asit ile bir kez yıkanır ve tamamen süzülünceye kadar beklenir. Alttan süzülen su, tam nötr reaksiyon verinceye kadar, süzgeç ve kalıntı, sıcak destile su ile, sonra üç kez aseton ile yıkanır. Aseton tamamen süzüldükten sonra bir kez de eterle yıkanır. Süzgeç kağıdı dikkatle huniden ayrılır, katlanır ve bir saat camı üzerine yerleştirilir. 105°C'da dikkatle kurutulur ve tartılır. Kuru ve tartılmış kalıntı süzgeç, tartısı belli bir krozeye yerleştirilir, 500 - 550°C'da küllendirilir. İçinde kül bulunan kroze yeniden tartılır.
Sonuç: Ham selüloz % g - A - B
Burada;
A = Kurutulmuş süzgecin selülozla birlikte ağırlığı, g
B = Süzgeç kağıdının önceden bulunan darası, g’dır.
Saf selüloz % g = C - F
Burada;
C = Ham selüloz, g
F = Selülozlu süzgeç, kağıdı ve kroze ağırlığından küllendirmeden sonraki ağırlığın çıkarılması ile elde olunan değer (g) dir. (Kaynak 2)
4. ET VE ET ÜRÜNLERİNDE HAM PROTEİN TAYİNİ
Yöntem I:
Ham protein tayini 3 aşamadan oluşmaktadır.
- Digestion (Yakma): Bu kısımda proteinde bulunan azot (NH4)2 SO4, haline getirilir. Organik maddeden 2 g tartılarak Kjeldahl balonuna alınır. Üzerine
Titrasyon: Oluşan NH3 toplama kabında normalitesi belli standart bir asit ile titre edilir.
%Ham Protein
A = NH3 tarafından tutulan N/1O luk asitin ml si.
F = Azotu proteine çevirme katsayısı (6.25),
m = Alınan numune miktarı (g).
Yöntem 2:
Bu yöntemde de 3 aşama vardır:
- Digestion (Yakma): Homogenize edilmiş 2 g numune tartılır. Üzerine katalizör olarak 15 g K2SO4 (susuz) ve 0.5 g CuSO4 H2O konur. Kaynama taşı atıldıktan sonra 25 ml derişik H2SO4 eklenir. Isı ayarı yapılarak yakılır.
- Destilasyon: 40°C ye kadar soğutulan balona 50 ml destile su konur. Karıştırılır ve soğumaya bırakılır. 50(1 ml lik bir erlen içine 50 ml % 4 lük H3BO3 (borik çözeltisine 4 damla indikatör konarak karıştırılır). Ve balon adaptörün ağzı sıvıya batacak şekilde yoğunlaştırıcının altına yerleştirilir. Kjeldahl balonunun sıvıya batacak içindekilere aşağıda belirtilen işlemlerden biri uygulanır.
- Buharla damıtmada: Kjeldahl balonunun içindekiler damıtma cihazının içine aktarılır ve balon yaklaşık olarak 50 ml su ile çalkalanır. Üzerine 100 ml % 33 NaOH çözeltisi konur. Bu çözelti balona dikkatlice aktarılır. İki tabakanın karışması engellenir. Sonra hemen balon damıtma cihazına takılır. Alkali sıvı kaynayıncaya kadar içinden buhar geçirilerek ısıtılır ve buna 20 dakika devam edilir. Köpürmeyi azaltmak için balon önce yavaş ısıtılır. Damıtma ürünün hacmi en az 150 ml olmalıdır.
- Normal damıtmada: Kjeldahl balonunun içindekiler yaklaşık olarak 300 ml su ile seyreltilir. 15 dakika sonra 100 ml % 33 NaOH dikkatlice balona konur. Karışım sıçramaya başlayıncaya veya 250 ml damıtma ürünü toplayıncaya kadar damıtma sürdürülür.
- Titrasyon: Erlen içindekiler N/10 HCI ile titre edilir. (Kaynak 4)
% = 0.0014 (V1 – V0)
V0 = Tanık deney için kullanılan 0.1 NHCl hacmi, (ml)
V1 = Deney numunesi için kullanılan 0.1 NHCl hacmi (ml)
m = Deney numunesinin ağırlığı (g)
Not : Yeni reaktif miktarları veya yeni hazırlanmış çözeltiler kullanıldığında daima tanık bir deney yapılır.
a : Harcanan hidroklorik asit (ml)
m : Örneğin miktarı (g)
Ham protein 100 g örnekte gram olarak miktarı aşağıdaki denklemden hesaplanır :
Ham protein = Toplam azot miktarı x 6.25
5. ET VE ET ÜRÜNLERİNDE HİDROKSPROLİN TAYİNİ
a. Prensip
Örnek HCI ile kaynatılarak dekompoze edilir. Hidroksiprolin yağın ayrılmasından sonra kloramin T ile oksitlenir. Oksidasyon ürünü 4-dimetilaminobenzaldehit'le kırmızı renkli bileşikler oluşturur. Bu maddeleri içeren ölçüm solüsyonunun ekstinksiyonu yaklaşık 558 nanometrede ölçülür. Elde edilen değer doğrudan doğruya hidroksiprolin konsantrasyonunu gösterir.
b. Kimyasal maddeler
Analiz saflığında kimyasal maddeler kullanılmalıdır.
- HCI (yakl. 6 N)
- Benzin (kaynama noktası 60-80ºC arasında)
- pH değeri yaklaşık 6.8 olan tampon solüsyonu ( 26 g sitrik asit-monohidrat, 14 g pul halinde sodyum hidroksit ve 78 g susuz asetat yaklaşık 500 ml suda çözündürülür, üzerine kimyasal saflıktaki sodyum etilmerkurittiyosalisilat'dan 100 mg. ilave edilir ve 1000 ml'lik bir balona aktarılır. sonra 250 ml 1-proponal ilave edilerek işaret noktasına kadar doldurulur. Tampon solüsyonu, ışıktan korumak ve 4ºC da saklanmak koşuluyla yaklaşık 2 ay dayanır).
- Hidroksiprolin karşılaştırma solüsyonları.
- Hidroksiprolin stam solüsyonu (600 mg/l, kitlesel konsantrasyon)
"Biyokimyasal amaçlı 120 mg L-hidroksiprolin suda çözündürülür. Eriyik 200 ml'lik ölçülü balonda işaret noktasına tamamlanır. Stam solüsyonu doldurulmadan önce 50 mg saf sodyum etilmerkurittiyosalisilat'la konserve edilebilir". Bu ana solüsyondan alınan 5 ml'lik kısım 500 ml'lik bir ölçü balonuna pipete edilip su ile işaret noktasına tamamlanır.
- Hidroksiprolin standart solüsyonları (Yukarıda belirtildiği gibi seyreltilmiş hidroksiprolin stam solüsyonundan 10, 20, 30 ve 40 ml'lik kısımlar 100 ml'lik ölçü balonlarına pipete edilirler. Her seferinde 30 mg sodyum etilmerkurittiyosalisitat ilavesinden sonra işaret noktasına tamamlanırlar. Bu standart solüsyonların konsantrasyonları 60, 120, 180 ve 240 Mg / 100 ml olur).
Standart eriyikler oda sıcaklığında yaklaşık 1 hafta; 4ºC da ise 2-3 ay dayanırlar.
- Oksidasyon reaktifi (1.4 g kloramin T tampon solüsyonunun 100 ml'sinde çözündürülür).
Işıktan korunmak ve 4'C da saklanmak kaydıyla yaklaşık bir hafta tazeliğini korur.
- Renk reaktifi (10.0 g 4- dimetilaminobenzaldehit %60'lık perklor asidinin 35 ml`sinde eritilir. Bu çözeltiye 65 ml 2- propanol yavaş yavaş katılır). Bu çözelti kullanılacağı gün hazırlanmalıdır.
c. Araç ve gereçler, - Alüminyum veya plastik folyalar
- Balon veya erlenmeyer (100 ml kapasiteli, su veya hava ile soğutulan geri soğutucu ile donatılmış).
- Elektrikli ısıtıcı (ayarlı saatle birlikte)
- Cam huni (yaklaşık 100 mm çapında)
- Katlanmış filtre (18.5 cm çapında)
- Erlenmeyer balonu (dar boyunlu, 500 ml kapasiteli)
- Termostatlı su banyosu (60'C'da sabit kalacak özellikte)
- Cam küvetler (kalınlıkları 1 cm)
- Spektrofotometre veya fotoelektrik kolorimetre (Absorpsiyon maksimumu 558 nanometrede olan interferans filtreli)
d. İşlem Örnek analize alınmadan önce oda sıcaklığında bekletilmeli ve manuel olarak iyice karıştırılmalıdır. En iyisi homojenizatör kullanılmasıdır.
Örnekten tam 4 g tartılarak bir balona veya erlenmeyere (100 ml'lik) alınır. Üzerine 30 ml HCl ve birkaç sünger taşı konulur..Isıtıcı üzerine yerleştirilen balondaki eriyik hafif ısıtılarak kaynama noktasına getirilir ve 8 saat kaynatılır.
Elde edilen hidrolizat su ile kantitatif olarak 500 ml'lik bir ölçü balonuna aktarılır, üzerine 5 ml benzin konulup işaret noktasına kadar su ile doldurulur. Benzin ve içinde çözülmüş olan yağın oluşturduğu tabaka işaret çizgisinin üzerinde yer almalıdır. Balon içeriği iyice çalkalandıktan sonra yağ içeren benzin kitlesi emilerek uzaklaştırılır ve sulu kısım katlanmış filtreden 500 ml'lik bir erlenmeyer'e filtre edilir.
Hidrolizat oda sıcaklığında 1 hafta, buz dolabında 4 hafta saklanabilir.
Hidrolizattan, beklenen hidroksiprolin konsantrasyonlarının 0.6 - 2.4 Mg / ml olacağı şeklinde uygun bir seyreltme hazırlanır. Bu işlem, kaide olarak 10 ml hidrolizatın 250 ml'lik balonda seyreltilmesiyle yapılır. Bu şekilde hazırlanan seyreltiden alınan 4 ml'lik kısım bir tüpe pipete edilir, üzerine 2 ml oksidasyon reaktifi ilave edilir, karıştırılır ve oda sıcaklığında 20 dakika dinlendirilir. Sonra 2 ml renk indikatörü ilave edilir. Tüp iyice çalkalandıktan sonra hemen 60ºC daki su hamamına konulur ve 15 dakika kadar tutulur. Sonra akar su altında tutularak 3 dakika soğutulur ve ölçüm yapılıncaya kadar 1/2 saat oda sıcaklığında bekletilir.
Solüsyonun ekstinksiyonu yaklaşık SS8 nanometrede, kalınlığı 1 cm olan bir cam küvette ölçülür.
Yukarda açıklandığı şekilde bir kör deneyin de birlikte yürütülmesi gerekir. Yalnız burada 4 ml seyreltilmiş hidrolizat yerine 4 ml su kullanılır. Kör deneyde belirlenen ekstinksiyon değerlerinden çıkarılmalıdır.
e. Kalibrasyon eğrisinin çizimi
Kalibrasyon eğrisinin belirlenmesi için seyreltilmiş hidrolizat yerine her seferinde hidroksiprolin standart solüsyonlarının 4 ml'si ile çalışılır.
Bulunan kör değerler ölçülen ekstinkisyon değerlerinden düşülmelidir. Kör değerin tespiti ve hidroksiprolin kalibrasyon değerlerinin belirlenmesi işlemi iki defa yapılmalıdır.
f. Değerlendirme
- Grafik değerlendirmesi: Standard solüsyonlardan elde edilen ekstinksiyon değerleri (optik dansite) milimetrik kağıt üzerinde bir koordinat sistemiyle hidroksiprolin miktarları karşısında Mg/ml olarak kaydedilirler.
Seyreltilmiş hidrolizatların bilinmeyen konsantrasyonlara halinde kullanılmasında optik dansiteye tekabül eden "x" konsantrasyonları Mg/ml olarak kalibrasyon eğrilerinden okunur.
0.6 Mg/ml'nin altındaki konsantrasyonlar değerlendirilemezler. Çünkü bunun altında kalibrasyon değerlerinin bir eğri ile gösterilmesi imkan dışıdır. Bu durumda tayinin daha yüksek konsantrasyondaki seyreltmeyle tekrar edilmesi gerekir.
- Kalibrasyon eğrisinin hesapta değerlendirilmesi: Kalibrasyon eğrisinin hesaplanması hidroksiprolin standart solüsyonlarıyla yapılan 4 çift ölçü değerine dayalı olarak gerçekleştirilir.
Hidroksiprolin
konsantrasyonu Optik dansite
(Mg/ml)
x l 0.6 y l
x 2 1.2 y2
x 3 1.8 y3
x 4 2.4 y4
g. Hidroksiprolin miktarının hesaplanması
100 g örnekte g olarak mevcut hidroksiprolin miktarı (w) aşağıdaki denklemden bulunur.
W =
V: 10 ml hidrolizatın 250 ml'lik balonda su ile inceltilmesinden sonra elde edilen milimetrik hacmi,
x: Seyreltilmiş hidrolizatta Mg/ml olarak hidroksiprolin konsantrasyonu,
m: Tartılan örneğin miktarı (g)
6. TOPLAM KREATİNİN TAYİNİ
a. Cihaz ve Malzemeler- Spektrofotometre (500 mm’de ölçüm yapabilen, optik hücresinin boyu 1 cm olan)
- Su banyosu veya otoklav.
b. Reaktifler- Pikrik asit (pKa) çözeltisi (%1’lik pikrik asit çözeltisi süzülür. 0.1 N hidroklorik asit çözeltisinde çözülür. 250 ml’lik bir ölçülü balona aktarılır ve 0.1 N hidroklorik asit çözeltisi ile işaret çizgisine tamamlanır. Bu çözeltiden pipetle 10 ml alınıp; 100 ml’lik bir ölçülü balona aktarılır ve suyla işaret çizgisine tamamlanarak standart kreatinin çözeltisi hazırlanır. Çözelti hazırlandıktan sonra bekletilmeden hemen kullanılmalıdır.
Standart kreatin çözeltisinin 1 ml’si, 0.1 mg kreatinin ihtiva eder.
c. İşlem
Analiz için hazırlanmış numuneden 10 g – 25 g (0.1 g hassasiyetle) 150 ml’lik bir beher içine tartılır. Amonyak ihtiva etmeyen 8 ml – 10 ml damıtık su ilave edilir. Daha sonra 50 ml damıtık su ilave edilerek analiz numunesi iyice ezilir. 3’er dakikalık aralıklarla 15 dakika karıştırılır. Çözünmeyen kısmın çökmesi için 2 dakika – 3 dakika bekletilir. Süzgeç kağıdı kullanılarak 500 ml’lik bir ölçülü balona süzülür. Beher içinde kalan kısım; 50 şer ml soğuk ve amonyak ihtiva etmeyen suyla 3 defa, 25 ml’lik soğuk suy il de 4 defa tekrarlanır. Beherde kalan çökelti, süzgeç kağıdına aktarılır ve 10 ar ml soğuk suyla 3 defa, ölçülü balon içinde yıkanır. Çökeltinin yıkama işi bittikten sonra, ölçülü balon karıştırılır ve işaret çizgisine kadar su ile tamamlanır. 500 ml’lik ölçülü balondaki çözeltiden150 ml alınarak 250 ml’lik bir beher içine aktarılır. Beher, kaynar su banyosu üzerinde, arasıra karıştırılarak; çözelti miktarı 40 ml kalıncaya kadar buharlaştırılır. Fenolftaleyn indikatör çözeltisi kullanılarak nötrleştirilir. 1 ml 0.1 N asetik asit çözeltisi ilave edilir ve 5 dakika hafifçe kaynatılır. Oda sıcaklığında soğutulur ve süzgeç kağıdından 250 ml’lik ayrı bir behere süzülür. Birinci beher 4 defa sıcak su ile yıkanarak her seferinde süzgeç kağıdı üzerine aktarılır. Sonra süzgeç kağıdında kalan çökelti yıkanır.
Süzüntü, su banyosunda uçurulur ve 5 ml – 10 ml su ile yıkanarak 50 ml’lik ölçülü bir balona aktarılır. 10 ml, 2N hidroklorik asit çözeltisi ilave edilir ve karıştırılır. Kaynar su banyosunda 2 saat veya 117 ºC – 121 ºC’deki otoklavda 20 dakika hidrolize edilir.
Soğutulur ve 10 ml 2 N sodyum hidroksit çözeltisi ilave edilir. 1 litrelik bir ölçülü balona aktarılır ve ölçülü balon işaret çizgisine kadar suyla tamamlanır, Bu çözeltiden 5 ml kuru ve temiz 100 ml'lik ölçülü balona aktarılır. 15 ml damıtık su ilave edilir. Ayni zamanda 100 ml lik ölçülü bir balona 20 ml su konularak düzeltme çözeltisi yapılır. 100'er ml'lik ölçülü balon1ardan her birine 20 ml pikrik asit çözeltisi ve 2.5 ml 2 N sodyum hidroksit çözeltileri ilave edilir ve 21ºC ± 1ºC'deki su banyosuna konulup; arasıra karıştırılarak 15 dakika bekletilir. Sonra, her iki ölçülü balon suyla işaret çizgisine kadar tamamlanır. Karıştırılır ve 15 dakika içinde; 1 cm'lik tüpler kullanılarak, düzeltme çözeltisine karşı deney çözeltisinin 500 nm'deki absorbansı ölçülür.
d. Kalibrasyon eğrisinin çizimi
100 ml'lik 11 adet ölçülü balonların her birine 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 0.10 ml standard kreatinin çözeltisi ilave edilir. Her bir ölçülü balon sırasıyla; 0 mg, 0.1 mg; 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg ve 1 mg kreatinin ihtiva eder. Deney çözeltisi için yapılan işlemler aynen uygulanır. Suyla her bir ölçülü balon 20 ml'ye tamamlanır. 20 ml pikrik asit çözeltisi ve 2.5 ml 2 N sodyum hidroksit çözeltisi ilave edilir. 21ºC ± 1ºC'deki su banyosunda arasıra karıştırılarak 15 dakika bekletilir. Ölçülü balonlar işaret çizgisine suyla tamamlanır ve 0 mg kreatinin ihtiva eden çözeltiye karşı 1 cm'lik tüplerde, 15 dakika içinde; 500 nm'de absorbansları okunur. Absorbans, ortamın sıcaklığına göre değişeceğinden 0 mg kreatinin ihtiva eden düzeltme çözeltisi her üç okumada bir değiştirilir.
100 ml çözeltideki kreatinin miktarları apsise, absorbansları ordinata işaretlenerek kalibrasyon eğrisi çizilir. Kalibrasyon eğrisinden, deney çözeltisindeki kreatinin miktarı bulunur.
7. ET VE ET ÜRÜNLERİNDE KOKUŞMANIN TESBİTİ
ET VE MAMÜLLERİ – KOKUŞMANIN TESBİTİ I. YÖNTEM: (NESSLER ÇÖZELTİSİ İLE AMONYAK ARANMASI)
Araç - Gereç : - Petri kutusu
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler :
- Nessler Çözeltisi; 16 g potasyum iyodür, 24 g cıva iyodür, 75 g potasyum hidroksit 560 g suda çözülür.
İşlem :
Bir petri kutusuna muayenesi yapılacak numuneden bir kesit alınarak konur, üzerine Nessler çözeltisi dökülür. Kokuşma varsa portakal renginden koyu portakal - kahve rengine kadar değişen bir renk oluşur.
II. YÖNTEM: (KURŞUN ASETAT İLE HİDROJEN SÜLFÜR ARANMASI)
Araç - Gereç:
- Süzgeç kağıdı; % 10’luk Kurşun Asetat çözeltisine daldırılmış ve kurutulmuş
- Petri kutusu veya tüp
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler:
- Kurşun asetat çözeltisi; % 10'luk
İşlem:
Numune ince olarak kıyılır ve ağzı kapaklı bir petri kutusuna konur. Petri kutusunun kapağı içine % 10'luk kurşun asetatlı süzgeç kağıdı yerleştirilir ve ağzı kapanarak 10 - 15 dakika bekletilir veya kıyılan madde bir tüpe konur. İnce yaprak halinde kesilmiş ve önceden %10'luk kurşun asetat çözeltisine daldırılarak kurutulmuş süzgeç kağıdı tüpe daldırılır ve bir ucu tüpün kenarına gelmek üzere ağzı bir tıkaçla sıkıca kapanır ve beklenir. Kağıt üzerinde beliren siyah renk, kokuşma olduğunu gösterir.
III. YÖNTEM: (AMONYAK TAYİNİ)
Araç - Gereç:
- Soğutucu
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler: - Karbontetraklorür
- Sülfürik asit (H2S04); 1/100'lük
İşlem: 10 g numune bir balona konur üzerine, örtünceye kadar karbontetraklorür ilave edilir. Bu balon bir ucunda 1/100 H2S04 bulunan bir soğutucuya bağlanır. Kjeldahl yöntemi ile amonyak tespit ve doze edilir.
100 g da 33 mg amonyak bulunması halinde numune kokmuş sayılır.
Sonuç:
(aNı - bN2) X 0,017
Amonyak miktarı = X 100
M
Burada;
A = H2SO4 hacmi
B = NaOH hacmi
N1 = Sülfürik asidin normalitesi
N2 = Sodyum hidroksitin normalitesi
M = Numune miktarı g ,
0,017 = 1 ml N H2SO4 tarafından tutulan amonyak, g olarak
8. ET VE MAMULLERİ - KÜL TAYİNİ
Yöntemin İlkesi: Et ve et mamullerinin magnezyum asetat çözeltisi katılarak bir su banyosu üzerinde kurutulması ve 550 - 600°C sıcaklıktaki bir kül fırınında yakılması, soğutulması ve katılan magnezyum asetat çözeltisinden oluşan magnezyum oksit miktarının çıkarılması sonucu elde olunan kalıntının tayini ilkesine dayanır.
Araç - Gereç: - Et kıyma makinesi; laboratuar tipi, delik çapları 4 mm'yi geçmeyen bir ayrıcısı olan, etüv sıcaklığı ayarlanabilen
- Kül fırını, 550 - 600°C'ye ayarlanabilen
- Su banyosu
- Desikatör, etkili bir kurutucusu olan.
- Analitik terazi, ± 0,0001 g duyarlıkta
- Porselen kroze
- Genel laboratuar araç ve gereçleri
Ayıraç ve Çözeltiler:
Magnezyum asetat çözeltisi; yaklaşık 150 g/L.
15 g susuz magnezyum asetat Mg (COOCH3) 2 veya 25 g magnezyum asetat tetrahidrat Mg (COOH3) 2 4H2O suda çözülür ve 100 ml'ye seyreltilir, 1 ml çözeltideki magnezyum oksit miktarı hesaplanır.
İşlem: Numune en az iki kez kıyma makinesinden geçirilerek ve karıştırılarak homojen hale getirilir.
Kroze 20 dakika süre ile kül fırınında 550 - 600°C'da ısıtılır. Desikatörde soğutulur ve 0,0001 g duyarlıkla tartılır.
Hazırlanmış numuneden 5 g krozeye aktarılır, düzgün bir şekilde yayılır ve 0,001 g duyarlıkta tartılır.
Krozeye konan numune üzerine 1 ml magnezyum asetat çözeltisi mümkün olduğu kadar eşit şekilde dağıtılarak katılır.
Kroze hafifçe kaynayan su banyosu üzerinde 30 dakika tutulur, sonra bir elektrik ocağı veya bek alevi üzerinde kömürleşinceye kadar sıcaklık artırılarak dikkatle yakılır. Kül fırında beyaz kül elde edilinceye kadar 550 - 600°C de yakılır.
Kroze fırından çıkarılarak desikatöre konulur, oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 0,0001 g duyarlıkta tartılır. Külde karbonlaşmış zerreler görülürse kroze tekrar fırına konulur ve 30 dakika daha bekletildikten sonra desikatöre alınır. Tekrar oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 0,0001 duyarlıkla tartılır. Kızdırma işlemi birbiri ardından yapılan tartılar arasındaki fark 0,001 g’dan çok olmayıncaya kadar tekrarlanır.
Aynı işlemle hazırlanan numune üzerinde paralel iki tayin yapılmalıdır.
Sonuç : Numunedeki kül miktarı (K), ağırlık yüzdesi olarak aşağıdaki formülle hesaplanır :
100
K = (M2 – M0 – M3) X
Mı-M0
Burada;
M0 = Krozenin ağırlığı, g
Mı = Deney numunesi ile birlikte krozenin ağırlığı, g
M2 = Yakma işleminden sonra meydana gelen kalıntı ile birlikte krozenin ağırlığı, g
M3 = Magnezyum asetat çözeltisi katılarak meydana gelen magnezyum oksidin(MgO)
ağırlığı, g'dır.
Elde edilen sonuçlar arasında uygunluk varsa iki tayinin aritmetik ortalaması sonuç olarak alınır. Sonuç 100 g’lık numunede 0,02 duyarlıkta kül miktarı olarak kaydedilir.
9. ET VE ET ÜRÜNLERİNDE NİTRAT TAYİNİ
Prensip:
Deney numunesindeki nitratın H2SO4, KmnO4 ve Fosfotungustik asit aracılığı ile nitrat okside edilmesi ve oluşan rengin 450 nm’de spektrofotometre de okunması ilkesine dayanır.
Araç ve Gereçler:• Spektrofotometre
• Destilasyon düzeni
• Genel laboratuar araç ve gereçleri
Kimyasal Çözeltiler:• M. Ksilenol (2, 4 Dimethylphenol)
• Gümüş amonyum hidroksit çözeltisi (5 gr içinde nitrat bulunmayan Ag2SO4, 60 ml NH4, OH da çözülür. Kaynayıncaya kadar suyu uçurulur, soğutulur, su ile 100 ml’ye tamamlanır.
• Bromkresol yeşil belirteci (0.1 N 0.1 gr bromkresol yeşili, 1.5 ml NaOH'da çözülür ve su ile 100 ml’ye tamamlanır.
• Standart nitrat çözeltisi (0.1805 gr KNO3 1 lt suda çözülür veya 17.85 ml 0.1 N HNO3, 1 lt'ye su ile tamamlanır.
• H2SO4 çözeltisi (1 hacim asit + 10 hacim su) ve (3 hacim asit + 1 hacim su)
• Fosfotungustik asit %20'lik
İşlem:
5-10 gr. homojenize edilmiş numune 100 ml.'lik behere konur ve üzerine 80 ml.'ik su ilave edilir. İyice karıştırılır. Zaman zaman karıştırılarak su banyosunda iyice ısıtılır. l00 ml.'lik butona alınır ve soğutulur. Soğutulduktan sonra, 100 ml.'ye tamamlanır, süzülür veya durulması için beklenir: Bundan 50 ml.'lik butona 40 ml. alınır.Üzerine 3 damla Bromkresol yeşili belirtecinden damlatılır. Renk sarıya dönüşünceye kadar damla damla H2S04 %10'dan katılır. Nitritlerin nitrata okside olmaları için 0,2 N KMnO4 çözeltisinden çalkalamak şekliyle ve damla damla uçuk pembe renk 1 dakika sabit kalıncaya kadar ilave edilir. Tekrar 1 ml. H2S04 ve l ml. %20'lik Fosfotungustik asit ilave edilir. Balon 50 ml.'ye tamamlanıp çalkalandıktan sonra süzülür.
Bu süzüntüden 500 ml.'lik bir ertene en çok 20 ml. aktarılır. hesaba göre 20 ml. fazla kullanmak gerekiyorsa, süzüntü hafif alkali yapılır ve suyu uçurularak konsantrasyon yükselir.
Bütün klorürlerin ve fazla Fosfotungustik asidin çöktürülmesi için yeteri kadar Ag-NH4OH çözeltisi katılır. Genelde 1-2 ml.yeterlidir. Süzmeden önce erlendeki miktarın 3 katı H2S04 katılır. Erlenin ağzı kapatılır, çalkalanır 35°C kadar soğutulur. l-2 damla m-ksilenol katılır. Tekrar ağzı kapatılır çalkalanır ve 30 dk. 30-40°C de saklanır.
Sarıdan kahverengimsi sari renk, nitratın varlığını gösterir. Nitratlama tamamlandıktan sonra üzerine 150 ml. su konur. Destilasyon cihazına alınarak içinde 5 ml. NaOH bulunan erlene 40-50 ml. destilat toplanır. Bu destilat 100 ml.'lik bulona alınarak su ile 100 ml.'ye tamamlanır. Spektrofotometre 1 cm. optik yollu küvetler kullanarak 450 nm okuma yapılır.
Standart Kurvenin Çizimi:
10 ml. Standart nitrat çözeltisi, 0.05 ml m-ksilenol ve 30 ml. H2SO4 su ile 500 ml’ye tamamlanır ve bundan bir seri standart çözeltiler hazırlanarak okunan absorbans değerine karşılık litrede mg. olarak nitrat değerleri işaretlenerek kurve çizilir.
Sonuç:
Spektrofotometre de okunan absorbans değerine karşılık standart kurveden nitrat miktarı hesaplanır.
10. NİTRİT TAYİNİPrensip:
Et mamullerindeki nitritin, Griess I ve Griess II ayraçları ile oluşturduğu kırmızı rengin Spektrofotometre de 520 nm. dalga boyunda ölçülmesi ilkesine dayanır.
Araç ve Gereçler:• Spektrofotometre
• Su banyosu
• Ölçü balonu 50, 100, 500 ve 1000 ml.
• Filtre kağıdı
• Genel laboratuar araç ve gereçleri
Kimyasal Çözeltiler:• HgCl2 çözeltisi
• Chlorofrom
• Griess 1 çözeltisi: 1,5 gr. Sülfanilik asit %15’lik 300 ml. Asetik asitte çözülür.
• Griess II çözeltisi: 0,5 gr alfa-naftilamin 60 ml. su ile ağzı kapalı kaynatılır. Sıcak çözelti 300 ml. %15’lik asetik asit üzerine süzülür.
• Tanık çözeltisi: 50 ml.’lik cam kapaklı ölçü ba
